DH10Bac 感受态细胞说明书

（Rev.A）

保存：-80℃保存，运输为干冰包装。自收货之日起液氮保存至少一年，-80℃保存至少6个月。

产品简介：

大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞是经特殊工艺制备的，适用于昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统中同源重组的菌株，用于产生重组Bacmid。使用pFastbacHTA质粒检测，转化效率最高可达2×10⁷CFU/ug，-80°C 保存几个月转化效率不发生改变。

基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara,leu)7697 galUgalK λ- rpsLnupG /pMON14272 / pMON7124

产品特点：
DH10Bac 细胞包含亲本Bacmid bMON14272 和辅助质粒 pMON7124。亲本Bacmid包含一个 mini-F 复制子、卡那霉素抗性基因、 Tn7 位点和 lac Z α-互补因子。att辅助质粒包含tns ABCD 区域，该区域提供了 mini-Tn7从供体质粒插入亲本Bacmid靶位点所需要的转座蛋白。供体如pFastBac系列质粒（pFastBac1，pFastBac Dual等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重组臂，Tn7R 和 Tn7L 之间包含庆大霉素抗性基因、昆虫病毒多角体基因启动子、多克隆位点和 SV40 病毒的PolyA加尾信号。当含有靶基因pFastBac的重组质粒转化到 DH10Bac 细胞后，发生重组后就可产生重组Bacmid，提取纯化重组Bacmid转染昆虫细胞 Sf9 或 Sf21 就可以包装产生昆虫病毒。

此外，DH10Bac 细胞中的 The φ80dlacZDM15 基因的产物可以实现β-半乳糖苷酶的α-互补现象，用于重组bacmid的蓝白斑筛选。

操作步骤（以下操作均按无菌条件的标准进行）：
制备含下面抗生素的 LB 固体平板：50 μg/ml kanamycin、7 μg/ml gentamicin、10 μg/ml tetracycline、100 μg/ml X-gal、40 μg/ml IPTG。
1.  取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用 DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以 100 μl感受态细胞为例。
2.  向感受态细胞悬液中加入 1-10 ng 重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置 30 分钟。
3.  将离心管置于 42 ℃水浴中放置 90 秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 2 分钟，该过程不要摇动离心管。
4.  向每个离心管中加入 900 μl无菌的 SOC（不含抗生素），混匀后置于 37 ℃ 200 rpm，摇床振荡培养 4 小时。
5.  用 SOC 培养基进行 10 倍梯度稀释，如分成 3 个稀释梯度 10^-1, 10^-2, 10^-3
6.  取 100 μl的各个梯度的培养物用于涂布。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养 24-48 小时。
7.  保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。

相关试剂及培养基的制备方法:
1. SOB 和 SOC 培养基：称取 20g 胰蛋白胨，5g 酵母粉，0.5g NaCl置于 1L 烧杯中加入约 800ml 的去离子水，完全溶解后再补加 10ml 250 mMKCl溶液，滴加 5M NaOH（约 0.2ml）调 pH 值 7.0。加入去离子水将培养基定容至 1L。121℃高温高压灭菌15min。使用时加入 5ml 灭菌的 2M MgCl₂溶液（此种培养基称为SOB）。再补加经 0.22 μm过滤除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此种培养基为 SOC）。
2. 转化复苏细菌用的液体 SOC 培养基：可以一次高压 50ml 液体培养基，无菌状态按 1ml 每管分装于高压灭菌的 1.5ml 离心管中，装于自封袋中，冻存于-20℃中，每次用一支。可以极大地避免培养基污染和减少劳动量。
3. LB 固体选择培养基：100ml LB 液体培养基中加入 1.5 g 琼脂粉，摇匀后，121℃高压灭菌 20 分钟。冷却至 50℃左右时加入相应浓度的抗生素（如氨苄青霉素，浓度通常为 100μg/ml），混匀后倒在细菌用的无菌培养皿中，等琼脂凝固后即可使用。
4. IPTG：称量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 灭菌水，浓度为 200mmol/L。用无菌 0.22 μm过滤膜过滤除菌。小份分装后，-20℃保存。
5. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20 mg/ml，小份分装（1 ml/份）后，-20℃避光保存。

注意事项：

1.     感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。

2.     实验过程中应严格无菌操作，防止其它 DNA 或杂菌的污染，避免为以后的筛选、鉴定带来影响。

3.     转化时，转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源 DNA 量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时 DNA 体积要小于感受态细胞体积的十分之一。

4.     转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/铺板 DNA 总量。

5.     为防止转化实验不成功，可以保留部分连接产物，以重新转化，将损失降到最低。