本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，在高盐状态下通过离心吸附柱特异性地结合溶液中的DNA，通过漂洗液将杂质和其它成分去除，最后通过低盐、高pH值的洗脱缓冲液将高纯度质粒DNA从纤维素膜上洗脱。我公司采用进口离心吸附柱，能高效、专一的吸附DNA。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于转染多种细胞及各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接等实验。

【使用说明】

溶液 P2含SDS，在低温条件下会产生沉淀，使用前放入37℃水浴帮助溶解，冷却到室温后使用。

每次使用前将溶液 P3 放在冰上预冷。

所有离心步骤均为使用台式离心机室温下进行离心，速度为12,000rpm (~13,400×g)。

【提取步骤】

 1、取2-4ml 过夜培养的菌液，12,000rpm 离心30秒，尽可能倒干或吸除上清，收集菌体。

选择适量体积菌液，菌体过多会影响裂解致使提取的质粒纯度降低。培养基尽量除尽，残留的培养基会降低质粒提取效率。

2、加250μl溶液P1重悬菌体，剧烈涡旋振荡至菌体完全散开。

*未彻底混匀的菌块，会影响细菌裂解，导致提取量和纯度偏低。

3、加250μl的溶液P2（注意溶液P2是否有沉淀），上下翻转5-8次使溶液充分混匀，室温放置3-4分钟。此时菌液应变得清亮、粘稠。

*温和地上下翻转充分混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA断裂！

*如菌体过多，加入溶液P2后不清亮，可以适当补加P2（后续P3溶液也要按比例多加）。溶液P2反应时间不要超过5分钟！以免质粒受到破坏。

4、加 350μl 溶液P3，立即温和地上下翻转5-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状物质。冰上静置 3-5 分钟，12,000rpm 离心10分钟。

*加入溶液P3后应该立即充分混匀, 以免产生SDS的局部沉淀。

5、小心吸取上清，加入吸附柱 B 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 离心30秒，倒掉收集管中的废液。

*吸取上清时要小心操作，宁可少吸一些体积也不能吸出沉淀，以免污染质粒。

6、加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7、加入400μl 漂洗液WB, 12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

8、将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心60秒，尽量除去漂洗液。

*漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。也可以将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇。

9、小心取出吸附柱 ，放入一个灭菌的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓冲液EB-1或者EB-2（洗脱缓冲液事先在60-70℃水浴中加热效果更好），室温放置 2 分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，再离心1分钟。

*洗脱体积越大, 洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高, 可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于 50μl。

*本试剂盒提供两种洗脱液EB和TE。EB（10mM Tris-HCl ，pH8.0），不含EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。如质粒DNA需长期保存，可以用TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0）洗脱，EDTA可能影响下游酶切反应。