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RealPAGE Bis-Tris预制胶(用于Blue/Clear非变性电泳)

RealPAGE Bis-Tris预制胶(用于Blue/Clear非变性电泳)

● 产品简介:

Blue/Clear Native PAGE(BN/CN-PAGE)是一种从生物样品(质膜,胞浆等)中分离分子量10 kD-10000 kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM,digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来,Blue Native PAGE (BN-PAGE)是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷,根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离;Clear Native PAGE(CN-PAGE)是电泳缓冲液中不加入任何染料,电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态,然而,其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外,BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在,使蛋白都覆盖上负电荷,可以分离碱性蛋白(pI>7);而CN-PAGE只适合于酸性蛋白(pI<7)的分离。

本产品可以用于分离分子量在 10 kD-10000 kD 的蛋白复合体,样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验,也可直接用于电洗脱制备蛋白。

● 运输和贮存:

本产品常温运输;凝胶4-8℃贮存,不要冷冻;有效期6个月。

● 使用说明:

一. 样品制备:

   该试剂盒不含样品制备的相关试剂。

二. 电泳:

2.1 拆开预制胶包装,将预制胶安装在合适的电泳槽中。

2.2 准备电泳缓冲液:

10×BN/CN电泳缓冲液稀释10倍即配成1×BN/CN电泳缓冲液。

2.2.1 CN-PAGE电泳:

内槽缓冲液(阴极缓冲液)和外槽缓冲液(阳极缓冲液)均直接使用1×BN/CN电泳缓冲液进行电泳。

2.2.2 BN-PAGE电泳:

外槽缓冲液使用1×BN/CN电泳缓冲液,内槽缓冲液按照下表配制:



1×蓝色阴极缓冲液


150 ml

10×BN/CN电泳缓冲液

15 ml

0.4% G-250 染料(电泳用)

0.75 ml

超纯水

定容至150 ml

2.3准备样品:

2.3.1 CN-PAGE电泳:

总体积

10 μl

蛋白样品

x μl

4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液

2.5 μl

超纯水

补至10 μl


不要加热

2.3.2 BN-PAGE电泳:

总体积

10 μl

10 μl


含去垢剂样品*

不含去垢剂样品

蛋白样品

x μl

x μl

4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液

2.5 μl

2.5 μl

5% G-250染料(蛋白上样)

0.25-1 μl

0.1 μl(终浓度0.05%)或不加

超纯水

补至10 μl

补至10 μl


不要加热

不要加热

样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。

例如样品中DDM终浓度为1%,则需要G-250终浓度为0.25%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.5 μl。

2.4电泳过程;

2.4.1 CN-PAGE电泳:

电泳内外槽均使用1×BN/CN电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔),轻轻拨出预制胶梳子,用1ml吸头冲洗加样孔3次,随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN电泳缓冲液,冰浴电泳,。

电泳条件(一板胶)

CN-PAGE电泳

恒电流

起始电压

结束电压

电泳时间


10 mA

70-90 V

280-300 V

1-1.5 h

冰浴电泳

2.4.2 BN-PAGE电泳:

BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液;内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液,冰浴电泳,等待电泳指示前沿到达凝胶1/3处时,将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液,继续后续电泳,因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。

BN-PAGE电泳条件(一板胶)

恒电流

起始电压

电泳时间

缓冲液


10 mA

80-110 V

20-25 min

1×蓝色阴极缓冲液

冰浴电泳

指示前沿至凝胶三分之一处,更换内槽缓冲液为1×BN/CN 电泳缓冲液

恒电流

继续电泳时间

结束电压

电泳总时间

缓冲液


10 mA

60-70 min

不要超过500 V

1.5- 2 h

1×BN/CN电泳缓冲液

冰浴电泳

三. 缓冲液配方:

3.1  10×BN/CN电泳缓冲液

终浓度  组份    500 ml

0.15 M  Bis-Tris   15.7 

0.5 M  Tricine    44.8 

超纯水 定容至500 ml

彻底溶解,测定pH应为7.0左右,不要调节pH。

3.2  0.4% G-250 染料(电泳用)

    100ml:0.4克考马斯亮蓝G-250,溶于100 ml超纯水中,漩涡搅拌2-3小时,至染料彻底溶解,4℃贮存。

3.3  4×BN/CN 蛋白上样缓冲液

组成:200mM Bis-Tris,40%甘油,200 mM NaCl,0.04%丽春红S  pH7.0

顺序

终浓度

原料

50 ml

1

200 mM Bis-Tris

粉末

0.418 

2

超纯水


20 ml




pH9.4

3

HCl


 200 μl




调节pH7.1 左右

4

40% 甘油

甘油

25 

5

200 mM NaCl

粉末

0.58 

6

0.04% 丽春红S

粉末

20 毫克

7

超纯水


定容至 50 ml




最终pH7.0 25

3.4  5% G-250 染料(上样用)

    组成: 5% G-250,500 mM 6-氨基己酸

    50 ml:称取2.5克考马斯亮蓝G-250,3.28克6-氨基己酸溶于50 ml超纯水中,漩涡搅拌2-3小时,至染料彻底溶解,4温度贮存。


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产品货号:gl6135

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